一氧化氮合酶神经元在大鼠翼腭神经节、耳神经节中的分布观察
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南京医科大学学报 2000年第5期第20卷 论著
作者：郭志红 郭晓东 韩群颖 王鹤鸣
单位：南京医科大学解剖学教研室，南京 210029
关键词：一氧化氮合酶；翼腭神经节；耳神经节
南京医科大学学报000516 摘 要 目的 观察头面部副交感神经节一氧化氮合酶(NOS)的分布特点。方法 用黄递酶组织化学染色法就NOS神经元在大鼠翼腭神经节、耳神经节中的分布作一观察。结果 在翼腭神经节、耳神经节中均可见大量NOS神经元，分布不均匀，成簇或散在分布，缺少区域特异性。尚可见从NOS神经元胞体发出的含NOS的节后纤维。结论 一氧化氮(NO)极可能是翼腭神经节、耳神经节节后纤维的基本神经递质之一。
中图号 R322.85
The Distribution of NOS-positive Neuron in Perygopalatine Ganglion, Otic Ganglion of Rat
, 百拇医药
Guo Zhihong, Guo Xiaodong, Han Qunying, et al.
(Department of Anatomy, Nanjing Medical University, Nanjing 210029)
Abstract Objective To explore the characteristic distribution of NOS in the ptergopalatine and otic ganglia. Methods We studied the distribution of NOS neurons in both ganglia of rat with NADPH-diaphorase histochemitry. Results There are a lot of NOS neurons in both ganglia. The distributions of NOS neurons are irregular and lacking speciality. The NOS also could be seen in postganglionic fibers. Conclusion The data indicate that NO is one of fundemental transmitter in both pose ganglionic fibre.
, 百拇医药
Key words nitric oxide synthases; perygopalatione ganglion; otic ganglion
一氧化氮(NO)的生物作用自80年代后期发现以来，受到广泛重视，已被公认为是一种新的神经递质。研究发现，NO的合成酶一氧化氮合酶(NOS)广泛存在于植物神经系统中，在植物神经节节前纤维及其神经元、副交感神经节神经元及其节后纤维、肠肌神经节神经元及其节后的纤维中均可见大量NOS分布[1～3]。但这些研究主要在腹腔植物神经节中进行，而对头面部的副交感神经节研究较少。为进一步了解头面部副交感神经节的支配机制，我们用黄递酶组织化学染色NOS神经元在大鼠翼腭神经节、耳神经节中的分布作一观察。
1 材料与方法
1.1 材料
成年SD大鼠6只，体质量250～300 g，南京医科大学动物中心提供。
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1.2 方法
固定：大鼠乙醚麻醉，开胸，左心室插管，阻断腹主动脉，0.1 mol/L PBS(pH7.4)30 ml冲洗，用4%多聚甲醛的PBS固定液(0.1 mol/L pH7.4)300 ml固定。取翼腭神经节、耳神经节置于固定液后固定3 h，含30%蔗糖的PBS(0.1 mol/L， pH7.4)4℃过夜。
切片：神经节冷冻切片，片厚20 μm，连续切片，间隔贴片，分为2套，室温下干燥。
染色：①实验组，5只大鼠的神经节，一套美蓝染色，观察神经节神经细胞分布情况；另一套行黄递酶组织化学染色，以显示NOS分布。②对照组，1只大鼠的神经节。
黄递酶组织化学染色：①漂洗，0.1 mol/L PBS(pH7.3)2 min，共2次。②孵育，加孵育液，37℃，1 h，避光。孵育液含0.3%Triton X-100、0.6 g/L硝基四氮唑蓝(NBT)、0.5 g/L还原型辅酶(NADPH，Sigma公司)。③终止反应，0.1 mol/L PBS冲洗。④漂洗，0.1 mol/L PBS 2 min，共2次。⑤脱水，70%、80%、90%、100%梯乙醇脱水1 min，共2次。⑥二甲苯透明2 min。⑦中性树脂封片。
, 百拇医药
对照组于第2步孵育液中不加入NADPH。
计数：中倍镜(×100)下用显微测微尺确定一单位面积(160 μm×160 μm)，每个神经节观察6～10张切片，每片观察3～5个单位面积，计数NOS神经元数，然后在同一神经节美蓝染色切片下的相邻切片上，计数出相同部位、相同面积的神经元总数，计算NOS神经元的阳性率。为避免重复计数，两套切片的神经元计数均以有完整的细胞核神经元为准，其余神经元不列入计数。
2 结 果
大鼠翼腭神经节位于翼腭窝内，上颌神经的腹内侧。我们观察到该神经节大多呈尾端膨大，向首端逐渐缩小。耳神经节位于卵圆孔下方，下颌神经主干内侧，呈圆形或卵圆形。
明视野显微镜下观察NOS阳性细胞在神经节内分布情况：对照组未发现染色现象。NOS阳性神经元表现为细胞核不染色，细胞质染色呈均匀分布的天蓝色，但阳性细胞染色深浅程度不一致，基本可分为浅染与深染两类。翼腭神经节、耳神经节中均可见大量NOS神经元存在(图1、2)，NOS神经元分布不均匀、成簇或散在分布，缺少区域特异性，而同一神经节的美蓝染色则显示神经节中细胞分布较为均匀。在一些切片中可见从NOS神经元胞体发出的含NOS的节后纤维(图3)。翼腭神经节、耳神经节NOS神经元的阳性率见表1、2。从表中可见两神经节的阳性率无显著差别(U=0.707，P>0.05)，但不同个体之间神经元阳性率存在一定的差异。
, 百拇医药
表1 翼腭神经节NOS神经元阳性率
1
2
3
4
5
左
右
左
右
左
右
左
右
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左
右
NOS阳性神经元数
276
356
232
284
342
314
262
273
330
295
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相应面积神经元总数
318
403
321
357
362
355
325
323
404
359
NOS神经元阳性率(%)
86.8
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88.3
72.3
79.6
94.5
88.5
80.6
84.5
81.7
82.8
NOS神经元阳性率(%)：
=83.96±4.56。表2 耳神经节NOS神经元阳性率
1
, 百拇医药
2
3
4
5
左
右
左
右
左
右
左
右
左
右
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NOS阳性神经元数
293
324
270
281
304
287
246
233
346
371
相应面积神经元总数
321
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358
315
365
359
318
322
278
399
405
NOS神经元阳性率(%)
91.3
90.5
85.7
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77.0
84.7
90.3
76.4
83.8
86.7
91.6
NOS神经元阳性率(%)：=85.80±4.28。
图1 翼腭神经节NOS神经元分布 (黄递酶组织
化学染色，×50)
, 百拇医药
图2 耳神经节NOS神经元分布 (黄递酶组织
化学染色，×50)
3 讨 论
对于神经元型NOS的显示，NADPH-黄递酶组织化学染色法因其简便、经济被广泛采用。Hope等[4]根据神经元型NOS和黄递酶可以同法提取且黄递酶底物NBT可以竞争性抑制NOS活性等因素，推测NOS和黄递酶是同一酶。Dawson等[5]用黄递酶组织化学法和神经元型NOS免疫组化法显示，表明两者在神经系统中具有同一性，因而可用NBT显示黄递酶的方法来显示神经元型NOS。也有少数实验指出，在中枢神经系统中，神经元型NOS和黄递酶并不具有严格的同一性。
对NOS在植物神经系统中分布的研究主要集中在腹腔神经节上， 对头面部的翼腭神经节也有报道。Kimura等[6]的实验指出，猫的翼腭神经节中，NOS阳性细胞几乎为100%。Hanazawa等[7]报道，在人的翼腭神经节中NOS阳性细胞约为86.2%。我们的实验表明在大鼠的翼腭神经节中NOS阳性细胞约占83.96%，与Hanazawa等[7]报道的人翼腭神经节中的NOS阳性率相近，而与Kimura等[6]报道猫的阳性率有一定的差别，这可能与种属差异有关。我们的实验表明在大鼠耳神经节中NOS阳性神经元大量存在，其阳性率和分布特点与翼腭神经节相近。神经元胞体发现蓝染的节后纤维说明胞体合成NOS并运输至节后纤维末梢。NOS神经元在翼腭神经节、耳神经节中的大量存在提示，NO极可能是这两个神经节节后纤维的基本神经递质之一。
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图3 翼腭神经节NOS神经元发出的含NOS的节后纤
维 (黄递酶组织化学染色，×100)
翼腭神经节、耳神经节的节后纤维主要分布在脑血管、鼻腔和腭部粘膜、腮腺等部位。对大脑动脉研究表明，其NOS神经纤维主要来自翼腭神经节，NO在自主神经系统中主要作为抑制非肾上腺素非胆碱能神经递质，对动脉有舒张作用。此外，翼腭神经节节后纤维也可通过乙酰胆碱(Ach)、血管活性肠肽(VIP)舒张脑血管。因此可以认为，翼腭神经节对脑血管舒张作用可能通过NO、Ach、VIP三者相互协同产生，同时，我们推测NO亦可通过扩张血管、增加血液的方式调节腺体的分泌。
参考文献
1，Zhu BS, Gibbins IL, Blessing WW. Preganglionic parasympathetic neurons projecting to the sphenopalatine ganglin contain nitric oxide synthase in the rabbit. Brain Res,1997,769(1):168
, 百拇医药
2，Okamura H, Umehara K, Tadaki N, et al. Sympathetic preganglionic neurons contain nitric oxide synthase and project to the superior cervical ganglion: combined application of retrograde neuronal tracer and NADPH diaphorase histochemistry. Brain Res Bull, 1995,36(5):491
3，Elfvin LG, Holmberg K, Emsonp, et al. Nitric oxide synthase, choline acetyltransferase, catecholamine enzymes and neuropetides and their colocacization in the anterior pelvic ganglion, the inferior mesenteric ganglion and the hypogastirc nerve of the male guinea pig. J Chem Neuroanat, 1997,14(1):33
, 百拇医药
4，Hope BT, Michael GJ, Knigge KM, et al. Neruonal NADPH diaphorase is a nitric oxide synthase. Proc Ntl Acad Sci USA, 1991,88:2811
5，Dawson TM, Bredt DS, Fotuhi M, et al. Nitric oxide synthase and nuronal NADPH siaphirase are identical in brain and peripheral tissue. Proc Ntl Acad Sci USA, 1991, 88:7797
6，Kimura T, Yu JG, Edvinsson L, et al.Cholinergic, nitic oxidergic innervation in cerebral arteries of the cat. Brain Res, 1997,773:117
7，Hanazawa T, Tanaka K, Chiba T,et al. Distribution and origin of nitric oxide synthasecontining nerve fibers in human nasal mucosa. Acta Otolaryngol Stockh, 1997,117:735
(1999-11-01收稿), 百拇医药
单位：南京医科大学解剖学教研室，南京 210029
关键词：一氧化氮合酶；翼腭神经节；耳神经节
南京医科大学学报000516 摘 要 目的 观察头面部副交感神经节一氧化氮合酶(NOS)的分布特点。方法 用黄递酶组织化学染色法就NOS神经元在大鼠翼腭神经节、耳神经节中的分布作一观察。结果 在翼腭神经节、耳神经节中均可见大量NOS神经元，分布不均匀，成簇或散在分布，缺少区域特异性。尚可见从NOS神经元胞体发出的含NOS的节后纤维。结论 一氧化氮(NO)极可能是翼腭神经节、耳神经节节后纤维的基本神经递质之一。
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The Distribution of NOS-positive Neuron in Perygopalatine Ganglion, Otic Ganglion of Rat
, 百拇医药
Guo Zhihong, Guo Xiaodong, Han Qunying, et al.
(Department of Anatomy, Nanjing Medical University, Nanjing 210029)
Abstract Objective To explore the characteristic distribution of NOS in the ptergopalatine and otic ganglia. Methods We studied the distribution of NOS neurons in both ganglia of rat with NADPH-diaphorase histochemitry. Results There are a lot of NOS neurons in both ganglia. The distributions of NOS neurons are irregular and lacking speciality. The NOS also could be seen in postganglionic fibers. Conclusion The data indicate that NO is one of fundemental transmitter in both pose ganglionic fibre.
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Key words nitric oxide synthases; perygopalatione ganglion; otic ganglion
一氧化氮(NO)的生物作用自80年代后期发现以来，受到广泛重视，已被公认为是一种新的神经递质。研究发现，NO的合成酶一氧化氮合酶(NOS)广泛存在于植物神经系统中，在植物神经节节前纤维及其神经元、副交感神经节神经元及其节后纤维、肠肌神经节神经元及其节后的纤维中均可见大量NOS分布[1～3]。但这些研究主要在腹腔植物神经节中进行，而对头面部的副交感神经节研究较少。为进一步了解头面部副交感神经节的支配机制，我们用黄递酶组织化学染色NOS神经元在大鼠翼腭神经节、耳神经节中的分布作一观察。
1 材料与方法
1.1 材料
成年SD大鼠6只，体质量250～300 g，南京医科大学动物中心提供。
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1.2 方法
固定：大鼠乙醚麻醉，开胸，左心室插管，阻断腹主动脉，0.1 mol/L PBS(pH7.4)30 ml冲洗，用4%多聚甲醛的PBS固定液(0.1 mol/L pH7.4)300 ml固定。取翼腭神经节、耳神经节置于固定液后固定3 h，含30%蔗糖的PBS(0.1 mol/L， pH7.4)4℃过夜。
切片：神经节冷冻切片，片厚20 μm，连续切片，间隔贴片，分为2套，室温下干燥。
染色：①实验组，5只大鼠的神经节，一套美蓝染色，观察神经节神经细胞分布情况；另一套行黄递酶组织化学染色，以显示NOS分布。②对照组，1只大鼠的神经节。
黄递酶组织化学染色：①漂洗，0.1 mol/L PBS(pH7.3)2 min，共2次。②孵育，加孵育液，37℃，1 h，避光。孵育液含0.3%Triton X-100、0.6 g/L硝基四氮唑蓝(NBT)、0.5 g/L还原型辅酶(NADPH，Sigma公司)。③终止反应，0.1 mol/L PBS冲洗。④漂洗，0.1 mol/L PBS 2 min，共2次。⑤脱水，70%、80%、90%、100%梯乙醇脱水1 min，共2次。⑥二甲苯透明2 min。⑦中性树脂封片。
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对照组于第2步孵育液中不加入NADPH。
计数：中倍镜(×100)下用显微测微尺确定一单位面积(160 μm×160 μm)，每个神经节观察6～10张切片，每片观察3～5个单位面积，计数NOS神经元数，然后在同一神经节美蓝染色切片下的相邻切片上，计数出相同部位、相同面积的神经元总数，计算NOS神经元的阳性率。为避免重复计数，两套切片的神经元计数均以有完整的细胞核神经元为准，其余神经元不列入计数。
2 结 果
大鼠翼腭神经节位于翼腭窝内，上颌神经的腹内侧。我们观察到该神经节大多呈尾端膨大，向首端逐渐缩小。耳神经节位于卵圆孔下方，下颌神经主干内侧，呈圆形或卵圆形。
明视野显微镜下观察NOS阳性细胞在神经节内分布情况：对照组未发现染色现象。NOS阳性神经元表现为细胞核不染色，细胞质染色呈均匀分布的天蓝色，但阳性细胞染色深浅程度不一致，基本可分为浅染与深染两类。翼腭神经节、耳神经节中均可见大量NOS神经元存在(图1、2)，NOS神经元分布不均匀、成簇或散在分布，缺少区域特异性，而同一神经节的美蓝染色则显示神经节中细胞分布较为均匀。在一些切片中可见从NOS神经元胞体发出的含NOS的节后纤维(图3)。翼腭神经节、耳神经节NOS神经元的阳性率见表1、2。从表中可见两神经节的阳性率无显著差别(U=0.707，P>0.05)，但不同个体之间神经元阳性率存在一定的差异。
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表1 翼腭神经节NOS神经元阳性率
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NOS阳性神经元数
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相应面积神经元总数
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NOS神经元阳性率(%)
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NOS神经元阳性率(%)：
=83.96±4.56。表2 耳神经节NOS神经元阳性率1
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NOS阳性神经元数
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相应面积神经元总数
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NOS神经元阳性率(%)
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NOS神经元阳性率(%)：
=85.80±4.28。图1 翼腭神经节NOS神经元分布 (黄递酶组织
化学染色，×50)
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图2 耳神经节NOS神经元分布 (黄递酶组织
化学染色，×50)
3 讨 论
对于神经元型NOS的显示，NADPH-黄递酶组织化学染色法因其简便、经济被广泛采用。Hope等[4]根据神经元型NOS和黄递酶可以同法提取且黄递酶底物NBT可以竞争性抑制NOS活性等因素，推测NOS和黄递酶是同一酶。Dawson等[5]用黄递酶组织化学法和神经元型NOS免疫组化法显示，表明两者在神经系统中具有同一性，因而可用NBT显示黄递酶的方法来显示神经元型NOS。也有少数实验指出，在中枢神经系统中，神经元型NOS和黄递酶并不具有严格的同一性。
对NOS在植物神经系统中分布的研究主要集中在腹腔神经节上， 对头面部的翼腭神经节也有报道。Kimura等[6]的实验指出，猫的翼腭神经节中，NOS阳性细胞几乎为100%。Hanazawa等[7]报道，在人的翼腭神经节中NOS阳性细胞约为86.2%。我们的实验表明在大鼠的翼腭神经节中NOS阳性细胞约占83.96%，与Hanazawa等[7]报道的人翼腭神经节中的NOS阳性率相近，而与Kimura等[6]报道猫的阳性率有一定的差别，这可能与种属差异有关。我们的实验表明在大鼠耳神经节中NOS阳性神经元大量存在，其阳性率和分布特点与翼腭神经节相近。神经元胞体发现蓝染的节后纤维说明胞体合成NOS并运输至节后纤维末梢。NOS神经元在翼腭神经节、耳神经节中的大量存在提示，NO极可能是这两个神经节节后纤维的基本神经递质之一。
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图3 翼腭神经节NOS神经元发出的含NOS的节后纤
维 (黄递酶组织化学染色，×100)
翼腭神经节、耳神经节的节后纤维主要分布在脑血管、鼻腔和腭部粘膜、腮腺等部位。对大脑动脉研究表明，其NOS神经纤维主要来自翼腭神经节，NO在自主神经系统中主要作为抑制非肾上腺素非胆碱能神经递质，对动脉有舒张作用。此外，翼腭神经节节后纤维也可通过乙酰胆碱(Ach)、血管活性肠肽(VIP)舒张脑血管。因此可以认为，翼腭神经节对脑血管舒张作用可能通过NO、Ach、VIP三者相互协同产生，同时，我们推测NO亦可通过扩张血管、增加血液的方式调节腺体的分泌。
参考文献
1，Zhu BS, Gibbins IL, Blessing WW. Preganglionic parasympathetic neurons projecting to the sphenopalatine ganglin contain nitric oxide synthase in the rabbit. Brain Res,1997,769(1):168
, 百拇医药
2，Okamura H, Umehara K, Tadaki N, et al. Sympathetic preganglionic neurons contain nitric oxide synthase and project to the superior cervical ganglion: combined application of retrograde neuronal tracer and NADPH diaphorase histochemistry. Brain Res Bull, 1995,36(5):491
3，Elfvin LG, Holmberg K, Emsonp, et al. Nitric oxide synthase, choline acetyltransferase, catecholamine enzymes and neuropetides and their colocacization in the anterior pelvic ganglion, the inferior mesenteric ganglion and the hypogastirc nerve of the male guinea pig. J Chem Neuroanat, 1997,14(1):33
, 百拇医药
4，Hope BT, Michael GJ, Knigge KM, et al. Neruonal NADPH diaphorase is a nitric oxide synthase. Proc Ntl Acad Sci USA, 1991,88:2811
5，Dawson TM, Bredt DS, Fotuhi M, et al. Nitric oxide synthase and nuronal NADPH siaphirase are identical in brain and peripheral tissue. Proc Ntl Acad Sci USA, 1991, 88:7797
6，Kimura T, Yu JG, Edvinsson L, et al.Cholinergic, nitic oxidergic innervation in cerebral arteries of the cat. Brain Res, 1997,773:117
7，Hanazawa T, Tanaka K, Chiba T,et al. Distribution and origin of nitric oxide synthasecontining nerve fibers in human nasal mucosa. Acta Otolaryngol Stockh, 1997,117:735
(1999-11-01收稿), 百拇医药